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免疫沉淀實驗代測

 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“protein A/G"特異性地結合到抗體（免疫球蛋白）的FC片段的現象開發出來的方法。

服務說明

1. 細胞培養（貼壁細胞：100mm細胞培養皿中單層細胞長滿80％-90％或者細胞培養瓶中細胞達到2-5×10⁷個，懸浮細胞：離心收集細胞，細胞達到2-5×10⁷個）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP細胞裂解液到細胞培養皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實驗結果則應加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現加現用】4℃裂解細胞10min，再用移液器反復吹打貼壁細胞，然后將細胞懸浮液轉移到15ml離心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP細胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實驗結果則應加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現加現用】洗滌細胞培養皿，將殘留裂解細胞轉入15ml離心管中；
4. 10000g、4℃離心細胞裂解懸浮液10min，將上清轉入新的15ml離心管中，冰上操作，然后測定蛋白濃度（取少量細胞裂解液變性后用于WB檢測目的蛋白）；

選做：A.向細胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（與IP及COIP實驗一抗種屬來源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），4℃搖轉孵育30min；

1.       ℃離心細胞裂解液5min，將上清轉入一個新的15ml離心管中，冰上操作，然后測定蛋白濃度（取少量細胞裂解液上清變性后用于WB檢測目的蛋白）；
2.  

5.  取以上細胞裂解液上清1ml（或者100-500μg細胞總蛋白）到1.5ml離心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同時加相同量的與一抗種屬來源相同的普通IgG作為陰性對照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具體一抗加入量根據IP級抗體使用說明書進行稀釋）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），用手指輕輕彈勻，4℃搖轉孵育過夜；

7.  4℃ 1000g離心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀復合物；

8.  將免疫沉淀復合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各種抑制劑）洗滌4次，每次4℃ 1000g離心5min，每次洗滌小心棄去上清；

9.  zui后一次洗滌之后，小心棄去上清后，加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同時將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD）后4℃1000g離心5min取上清；

10. 取20μL上清樣品用于WB檢測（選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗，這樣再選擇一個種屬交叉反應比較弱或者無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗，可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號。）

免疫沉淀實驗代測

實驗材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  貨號：SC-2003

2.IP細胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脫氧膽酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L。

IP實驗代測

注意事項

 1.細胞樣品量要達到2-5×10⁷個，裂解細胞要使用溫和型裂解液-IP裂解液，裂解完后不要加含巰基乙醇的上樣緩沖液變性，經免疫沉淀后再變性；

 2.IP及COIP實驗抗體使用量依據目的蛋白濃度確定，用量應該使目的蛋白*沉淀，一般按照IP級抗體使用說明進行稀釋（抗體使用單抗來避免污染，多抗也可以做，效果沒有單抗好），一般加入1μg；

 3.對于IP及 COIP實驗的目的蛋白（實驗zui后進行WB檢測的蛋白）分子量在25KD和55KD左右的，可能會被干擾（解決方案就是選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗或者使用交聯劑將抗體與A/G-珠子交聯，然后添加不含巰基乙醇的上樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-A/G-珠子復合物后，去除抗體-A/G-珠子復合物，上清中只含有目的蛋白）。